J.Chem. Software. Vol.3, No.2, p.65 (1996)

多変量回帰分析法による数種多環芳香族炭化水素の同時蛍光定量

山口茂六、熊谷　哲、西岡　洋

Ⅰ. 　緒　言

　光吸収や蛍光を用いた分析では共存する物質の吸収や蛍光の存在が定性や定量を大きく妨害し、発色や発光のための反応試薬が高感度であるにもかかわらず、共存物質の妨害が測定法の実用化を阻んできた例は数多く存在する。試料中の全ての物質が既知であり、スペクトルの非直線性をもたらす干渉がなければ、スペクトルに対するそれぞれの寄与を求め、これまでの線形重回帰分析法により濃度を推定できる。しかしながら、一般的には共存する物質が全て既知であることは期待できないし、互いに影響しあってスペクトルの直線性に影響を及ぼす。重回帰分析の欠点を克服するために主成分回帰分析法やＰＬＳ(Partial least squares)法が提唱されている^1-3)。これらの方法は説明変数に主成分分析で得られた主成分スコアを用いて最小自乗法によりモデルを構築する手法である。とくにS.Ｗｏｌｄ等によって提唱されたＰＬＳ法¹⁾は説明変数に加えて潜在変数を導入することにより説明変数の数がサンプル数を上回る場合でも検量モデルを構築することが出来る。逆行列演算を含まないために共線性の問題が生じない。潜在変数を通して説明変数の情報を順次使うので，ＰＬＳモデルの自由度を変えながら予測性能を検討することが出来るなどの利点があり期待されている⁴⁾。自動車などの排気ガスと共に排出される多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）は癌の誘因物質として知られ、大気中の浮遊粉塵中に存在し我々の健康に影響を与えている。その種類は多く、極めて微量のため古くは薄層クロマトグラフ等によりそれぞれのＰＡＨに単離後蛍光分析する方法⁵⁾が知られ、近年では分光蛍光検出器付属の高速液体クロマトグラフ法⁶⁾等が用いられている。これはＰＡＨの多くが特有の蛍光を発し，その蛍光スペクトルは比較的鋭いピークを持っているが、多くは重なっているので分離操作を必要とするからである。これはスペクトルデ－タのうち、最大発光波長のみを使い、大部分のスペクトル情報を捨てていたことに起因している。最近のパ－ソナルコンピュ－タの急速な普及と劇的な性能向上は得られたスペクトルデ－タの全てを用いる統計解析を実験室レベルで可能ならしめた。そこで著者等は選択性に問題があるが高感度である蛍光分析法とＰＬＳ法を組み合わせた分析法を共存する数種のＰＡＨの同時蛍光定量に適用し、本法による予測性能を調べた。

Ⅱ.　確認法（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）

　回帰分析の目的は独立に測定されたデ－タとサンプルのいくつかの属性との間の関係をモデル化することである。本研究では合成試料溶液の蛍光スペクトルと数種のＰＡＨの濃度の関係をＰＬＳ法を用いて検量モデルを作成することにより（１）式の関係が得られる。
　　　　　

　　　　　　　　　（１）
ここで

は検量モデル、

は独立変数で蛍光強度、そして

は従属変数でＰＡＨの濃度である。
　　　　　

　　　　　　　　（２）
（２）式は検量モデルから得られた予測値

と真の値

との関係を示したもので

は予測誤差を表している。適当な検量モデルを得る手法の一つとしてはＰＲＥＳＳ（Prediction Error Sum of Squares）が最小になる

の条件を求める方法である。
（３）式に予測誤差

とＰＲＥＳＳの関係を示した。
　　　　　

　　　　　　　（３）
ここで

は検量モデル作成のために用いた試料溶液の数を示している。（３）式を一般化してＳＥＰ（Standard Error of Prediction）を定義する。
　　　　　

　　　　　　（４）
検量モデルの因子数

の増加とともにＰＲＥＳＳは減少するが多くなりすぎるとオ－バ－フィットとなり、予測誤差の原因ともなるので因子数も考慮したＳＥＣ（Standard Error of Calibration）が提案されている。
　　　　　

　　　　　（５）
この因子数

はスコア、負荷、個有値からE.R.Malinowski⁷⁾によるＩＤＮ法やＦテストによって計算されるが経験的に両者の平均を採用している。
　ＳＥＰやＳＥＣによって得られた値は検量モデル作成に用いたデータセットについて計算して得られた値で、検量モデルとは別のデータセットについて検討したものではない。従って検量モデルの有効性に若干の問題が残っている。しかし、有効性を確認するためのデータセットが常に用意できるとは限らない。その解決策としてクロスバリデーション法が提案されている。これはデータセット中のサンプルを１つ除いた検量モデルを作成し、除いたサンプルの予測を行い誤差を記録する。この手法を全てのサンプルについて繰り返し、得られた誤差についてＰＲＥＳＳを計算する。これをＳＥＣＶ(Standard Error of Cross-validation)と定義する。これは検量モデル中にないサンプルを用いて計算したことになるのでより信頼性が高いと考えられている。本研究では５種類のＰＡＨについてそれぞれＳＥＰ、ＳＥＣおよびＳＥＣＶを計算しその平均値（

，

）を検量モデル作成の目安とした。尚、ＰＬＳ法の数学的背景については多数の論文^8-12)や成書^13-17)が出版されているので参照されたい。

Ⅲ.　実　験

Ⅲ．１　試　薬

　和光純薬製のベンゾ[ａ]ピレン(B[a]p)、ペリレン(Pery)、フルオランテン(Fluo)、ピレン(Py)およびクリセン(Chry)の約１０㎎を精秤し、無蛍光性のｎ－ヘキサン100mlに溶解して保存溶液とし、冷暗所に保存した。使用に際してはさらに１μg／mlに希釈したものを用いた。

Ⅲ．２　合成試料溶液

　　１０mlのメスフラスコを用いてベンゾ[a]ピレン、ペリレン、フルオランテン、ピレンおよびクリセンの濃度を0.01～0.1μg／mlの範囲で種々変化させて２９種類の合成試料溶液を調製した。

Ⅲ．３　測定装置

Table 1 Experimental conditions of fluorometry

Exλ（励起波長）	３０５ｎｍ
Emλ（蛍光波長）	３３０～５２０ｎｍ
ＰＭＴ　Ｇａｉｎ	Medium
励起バンド幅	１０ｎｍ
蛍光側バンド幅	１０ｎｍ
データの取り込み間隔	１.０ｎｍ

　調製した試料溶液の蛍光スペクトルの測定にはスペクトル補正をした日本分光工業社製分光蛍光光度計ＦＰ－７７７型（ＡＳＣＩＩ変換プログラム付属）を使用した。定量条件をTable 1に示す。

Ⅲ．４トレーニングセット

　Ⅲ．２で調製した２９種類の試料溶液の蛍光スペクトルをTable 1の条件で測定し、ブランク補正後ＡＳＣＩＩ形式に変換してロ－タスに読み込む。蛍光スペクトル部１９１カラムに５種類のＰＡＨの濃度項を加え２９×１９６のデ－タマトリックスを構築した。スペクトルデ－タ項および試料濃度項はそれぞれ独立変数および従属変数として定義した。このデ－タマトリックスを基にして試料数、デ－タ取り込み間隔など種々条件を変えて構築したトレ－ニングセットをTable 2に示した。このうち試料番号１～２１を検量モデル作成に用い、試料番号２２～２９を検量モデルの有効性の判定に用いた。

　　Table 2 Training sets

No. Training
Set Number　of
Samples Interval
(nm) Independent
Variables Dependent
Variables

1 D1 29 1 　191 5

2 D2 29 2 　96 5

3 D4 29 4 　48 5

4 D8 29 8 　24 5

5 D20 29 20 　10 5

6 D30 29 30 　7 5

No.	Training Set	Number　of Samples	Interval (nm)	Independent Variables	Dependent Variables
1	D1	29	1	191	5
2	D2	29	2	96	5
3	D4	29	4	48	5
4	D8	29	8	24	5
5	D20	29	20	10	5
6	D30	29	30	7	5

Ⅲ．５　デ－タ解析

　データのＰＬＳ１¹⁰⁾解析については、データを中央平均化(Mean Centering)した後InfoMetrix社製のPirouetteを用いＩＢＭ社製ＰＳ／Ｖ２４１１型（１６ＭＢラム付属）卓上型コンピュータ上でおこなった。

Ⅳ．　結果と考察

Ⅳ．１　蛍光スペクトル

５種類のＰＡＨ(0.1μg/ml)の蛍光スペクトルをTable 1の条件で測定した。結果をFig.1の(1)～(5)に示した。それぞれのＰＡＨは特徴のあるスペクトルを持つが重なっている。通常これらのＰＡＨを定量する場合、薄相クロマトグラフ法やガスクロマトグラフ法によりあらかじめ分離後個別に定量する方法が採用されている。スペクトル(6)はトレーニングセットに用いた合成試料溶液の蛍光スペクトルの一例である。共存している５種類のＰＡＨはお互いに干渉しているので５種類のＰＡＨを定量するには線形重回帰分析法よりもＰＬＳ法が有利である。

Ⅳ．２　試料数と，

　良好な検量モデルを作成する上でトレーニングセットの大きさが問題になる。トレーニングセットが小さいと未知の試料溶液の特徴を十分説明できないことは明白である。一方

Fig.1 Fluorescence spectra of PAHs.
(1) B[a]p:10^-1μgcm^-3; (2) Pery:10^-1μgcm^-3; (3) Fluo:10^-1μgcm^-3;
(4) Py:10^-1μgcm^-3; (5) Chry:10^-1μgcm^-3;(6) B[a]p:9×10^-2μgcm^-3,
Pery:10^-2μgcm^-3, Fluo:9×10^-2μgcm^-3,Py:4× 10^-2μgcm^-3,Chry:7×10^-2μgcm^-3; Solvent: n-Hexane; Exλ=305nm,Emλ=330～520nm.

Fig.2 Relationship between and the sample number of training set.
(1):D1,(2):D2,(3):D4,(4)D30

大きすぎるトレーニングセットは膨大な計算による誤差の集積が予測精度に影響することも考慮に入れなければならない。そこでTable 2の全てのトレーニングセットを用いて検量モデルに用いられる試料の数がＳＥＣとＳＥＣＶにおよぼす影響を調べた。Fig.2およびFig.3に結果の一部を示した。横軸はトレーニングセットを構成するために用いた試料溶液の数である。縦軸はトレーニングセットを用いて５種類のＰＡＨについて計算して得られたそれぞれのＰＲＥＳＳをＳＥＣおよびＳＥＣＶに換算した後平均したものである。図中の（１）、（２）、（３）および（４）はそれぞれＤ１、Ｄ２、Ｄ４およびＤ３０を表している。検討したトレーニングセットは何れもよく

Fig.3 Relationship between and the sample number of training set.
(1):D1,(2):D2,(3):D4,(4):D30

似た傾向を示すがＤ３０の場合、高いＳＥＣ値を示している。これは５種類のＰＡＨの内ベンゾ[a]ピレン、ペリレンおよびフルオランテンのＰＲＥＳＳが高いことが原因であった。これはこれらのＰＡＨの特徴を示す蛍光を十分に捕らえきれなかったためである。トレーニングセットの内Ｄ１～Ｄ８はほぼ同じ傾向を示し、Ｄ２０はこれらとＤ３０の中間的な傾向を示した。検討した範囲で値は試料数の増加に伴って僅かであるが減少傾向にあるが値は試料数が１２以上でほぼ一定の値を示している。

Ⅳ．３　検量モデル

　Ⅳ．２の検討でＤ１～Ｄ８のトレーニングセットを用いて構築される検量モデルはＳＥＣおよびＳＥＣＶの何れの条件においてもトレーニングセットに用いられる試料数が１２以上で同程度の予測性能を持つことが予想されるがＳＥＣおよびＳＥＣＶ間の予測性能の比較はできなかった。そこでTable 2 のトレーニングセットでＳＥＣおよびＳＥＣＶの検量モデルの構築に用いられなかった４個のデータを選び、５種類のＰＡＨの濃度項を削除して未知試料とし、 Fig.2およびFig.3の条件でそれぞれ構築した検量モデルを用いて５種類のＰＡＨの濃度を予測した。Fig.4はＤ４についての検討結果を示したものである。(1)および（2）はそれぞれFig.2およびFig.3におけ

Fig.4 Comparison of calibration model.
Trainingset:D4,(1):,(2):(SEC), (3): ,(4): (SECV)

るＤ４のおよびである。また(3)および(4)はそれぞれＳＥＣおよびＳＥＣＶに対応する検量モデルによるを示している。結果はとＳＥＣＶによる検量モデルによる(SECV) が検討したトレーニングセットの試料数の範囲で極めてよく似た傾向を示し、ＳＥＣの場合と比較してもＳＥＣＶの予測性能が高いことを示している。これは検討したＤ１、Ｄ２、Ｄ８についてもほぼ同様の傾向であった。

Ⅳ．４　予測性能

　合成した試料溶液の内、検量モデルに用いなかった４試料溶液より濃度項を除いたデータにⅣ．３で構築したＳＥＣＶの条件による検量モデルを適用し、予測性能を検討した。結果はＤ１～Ｄ４について、モデルに使用した試料数が１２～２０では同程度の良好な予測性能を示し、試料数の増加による影響は見られなかった。Table 3 はトレーニングセットＤ４、サンプル数１４の検量モデル（ＬｖＭ１４Ｄ４）を用いた場合の予測値および実際の値を示したものである。５種類のＰＡＨについて予測残差およびＰＲＥＳＳの最大はそれぞれ＋0.39（×10^-2μgcm^-3 ，Chry)および0.252（×10^-2μgcm^-3 ，Chry)であった。以上のことから、共存する数種類のＰＡＨをＰＬＳ法と蛍光分析法を組み合わせることによって簡便かつ精度良く同時定量する可能性が開かれたものと考える。今後は同時定量が可能なＰＡＨの種類や濃度範囲などの諸条件を検討していきたいと考えている。また、これまで共存物質の妨害のために実用化を阻まれたその他の分析方法についても本法の適用を検討していきたい。

Table 3 Simultaneous five components analysis of PAHs by means of PLS　

Sample no. B[a]p Pery Fluo Py Chry

1 Actual conc.
PLS, (10^-2μ㎝^-3) 4.00
3.97 7.00
6.82 7.00
6.80 10.00
9.74 10.00
9.72

2 Actual conc
PLS, (10^-2μ㎝^-3) 2.00
1.98 10.00
10.24 6.00
6.13 5.00
5.02 4.00
3.87

3 Actual conc.
PLS, (10^-2μ㎝^-3) 8.00
8.20 8.00
8.22 8.00
8.14 6.00
6.00 3.00
2.92

4 Actual conc.
PLS, (10^-2μ㎝^-3) 2.00
1.92 3.00
2.84 2.00
1.87 9.00
9.18 9.00
9.39

SEP(10^-2μ㎝^-3) 0.109 0.202 0.156 0.157 0.252

Average SEP of five components:0.175(×10^-2μ㎝^-3）; Model(LvM14D4)

Sample no.		B[a]p	Pery	Fluo	Py	Chry
1	Actual conc. PLS, (10^-2μ㎝^-3)	4.00 3.97	7.00 6.82	7.00 6.80	10.00 9.74	10.00 9.72
2	Actual conc PLS, (10^-2μ㎝^-3)	2.00 1.98	10.00 10.24	6.00 6.13	5.00 5.02	4.00 3.87
3	Actual conc. PLS, (10^-2μ㎝^-3)	8.00 8.20	8.00 8.22	8.00 8.14	6.00 6.00	3.00 2.92
4	Actual conc. PLS, (10^-2μ㎝^-3)	2.00 1.92	3.00 2.84	2.00 1.87	9.00 9.18	9.00 9.39
	SEP(10^-2μ㎝^-3)	0.109	0.202	0.156	0.157	0.252

Ⅵ.　文　献

1) W.J.Dunn,III, S.Wold, J.Edlund, S.Hellberg, and J.Gasteiger, Quant.Struct.Act. Relat.,3,131 (1984).
2) K.R.Beebe, and B.R.Kowalski, Anal.Chem. 59,1007A (1987).
3) H.Martens and T.Naes, "Multivariate Calibration", John Wiley & Sons, p.98 (1989).
4) 宮下芳勝, 佐々木慎一, "ケモメトリックス－化学パターン認識と多変量解析－", 共立出版, p. 55-56 (1995).
5) 松下秀鶴, 大気汚染研究, 10,723 (1976).
6) K.Ogan, E.Katz, W.Skavin, Anal. Chem., 51,1315 (1979).
7) E.R.Malinowski,"Factor Analysis in Chemistry", 2nd ed., John Wiley & Sons, p.98 (1991).
8) P.Geladi, and B.R.Kowalski, Anal.Chim. Acta., 185,1 (1986).
9) A.Lober, L.E.Wangen, and B.R.Kowalski, J.Chemom., 1,19 (1987).
10) R.Manne, Chemom.Intell.Lab.Syst. 2,187 (1987).
11) D.M.Haaland, and E.V.Thomas,"Partial Least-Squares Method for Spectral Analysis. 1. Relation to Other Quantitative Calibration Methods and the Extraction of Qualitative Information", Anal.Chem., 60,1193 (1988).
12) D.W.Osten, "Selection of Optimal Regression Models via Cross-Validation", J.Chemometrics, 2,39 (1988).
13) W.H.Press, B.P.Flanny, S.A.Teukolsky, and W.T.Vetterling,"Numerical Recipes", Cambridge University Press, p.52 (1986).
14) H.Wold, "Partial Least Squares", in S.Katz and N.L.Johnson, ed., Encyclopedia of Statistic Sciences, Vol.6, Wiley,New York, p.581 (1985).
15) S.Weisberg, "Applied Linear Regression",Chapter 5, John Wiley & Sons, New York (1982).
16) R.D.Cook, and S.Weisverg, "Residuals and Influence in Regression", Chapter2 John Wiley & Sons, New York (1982).
17) 相島鐵郎，ケモメトリックス，3,4,7章，丸善 (1992).

Return

No.	Training Set	Number　of Samples	Interval (nm)	Independent Variables	Dependent Variables
1	D1	29	1	191	5
2	D2	29	2	96	5
3	D4	29	4	48	5
4	D8	29	8	24	5
5	D20	29	20	10	5
6	D30	29	30	7	5

No.	Training Set	Number　of Samples	Interval (nm)	Independent Variables	Dependent Variables
1	D1	29	1	191	5
2	D2	29	2	96	5
3	D4	29	4	48	5
4	D8	29	8	24	5
5	D20	29	20	10	5
6	D30	29	30	7	5

多変量回帰分析法による数種多環芳香族炭化水素の同時蛍光定量

山口茂六、熊谷 哲、西岡 洋

Ⅰ. 緒 言

Ⅱ. 確認法（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）

Ⅲ. 実 験

Ⅲ．１ 試 薬

Ⅲ．２ 合成試料溶液

Ⅲ．３ 測定装置

Ⅲ．４ トレーニングセット

Ⅲ．５ デ－タ解析

Ⅳ． 結果と考察

Ⅳ．１ 蛍光スペクトル

Ⅳ．２ 試料数と，

Ⅳ．３ 検量モデル

Ⅳ．４ 予測性能

Ⅵ. 文 献